養(yǎng)細(xì)胞的小伙伴們都知道，細(xì)胞一定要傳代，因?yàn)榧?xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中不斷的繁殖，數(shù)量也隨之增加，然而培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶的空間有限，增殖受到抑制，所以必須將一部分細(xì)胞移至別的培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶，讓細(xì)胞有足夠生長(zhǎng)空間。

　　細(xì)胞傳代也不僅僅是為細(xì)胞安一個(gè)更大的“家"，更重要的，是使細(xì)胞系或細(xì)胞株進(jìn)一步增殖，這樣，我們才能有足夠的細(xì)胞做各種各樣的實(shí)驗(yàn)。

　　但是，對(duì)于傳代的時(shí)間，很多小伙伴都掌握不好，因?yàn)閷?duì)于不同的細(xì)胞來(lái)說(shuō)，判斷能否開(kāi)始傳代的標(biāo)準(zhǔn)略有不同，今天，我們就主要來(lái)聊一下，細(xì)胞傳代的時(shí)間問(wèn)題。

　　什么時(shí)候進(jìn)行細(xì)胞傳代?

　　對(duì)于貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)而言，判斷是否需要傳代主要看以下2個(gè)方面：

　　• 細(xì)胞密度：

　　貼壁培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、未達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)即應(yīng)進(jìn)行傳代，正常細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)會(huì)停止生長(zhǎng) (接觸抑制)，重新接種后需要較長(zhǎng)時(shí)間才能恢復(fù)，轉(zhuǎn)化細(xì)胞即使達(dá)到匯合狀態(tài)也能繼續(xù)增殖，但是在經(jīng)過(guò)大約兩個(gè)倍增時(shí)間后通常會(huì)變質(zhì)。類似地，

　　懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、未達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)也應(yīng)進(jìn)行傳代。達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)聚集成團(tuán)塊，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶時(shí)培養(yǎng)基會(huì)變得渾濁。

　　• 培養(yǎng)基耗竭：

　　生長(zhǎng)培養(yǎng)基 pH 值降低通常表示乳酸蓄積，乳酸是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物。乳酸有細(xì)胞毒性，而且 pH 值降低也是細(xì)胞生長(zhǎng)的不利因素。pH 值改變的速度通常取決于培養(yǎng)體系中的細(xì)胞濃度，細(xì)胞濃度越高，培養(yǎng)基耗竭的速度越快。

　　如果發(fā)現(xiàn) pH值迅速降低 (> 0.1–0.2 pH 單位)，同時(shí)細(xì)胞濃度增大，則應(yīng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。

　　細(xì)胞傳代時(shí)間安排

　　注意，一定要嚴(yán)格按照預(yù)定時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞傳代，這樣才能確保細(xì)胞的生物學(xué)行為穩(wěn)定，便于監(jiān)測(cè)其健康狀態(tài)。

　　要從某一接種密度開(kāi)始逐漸調(diào)整細(xì)胞接種密度，直到達(dá)到適合該細(xì)胞的穩(wěn)定生長(zhǎng)速度和產(chǎn)量，細(xì)胞偏離如此確定的生長(zhǎng)模式通常表示細(xì)胞健康狀況不佳 (例如：變質(zhì)、污染) 或者培養(yǎng)體系的某一組分功能異常 (例如：未達(dá)到最佳溫度，培養(yǎng)基過(guò)于陳舊)。

　　強(qiáng)烈建議大家保留詳細(xì)的細(xì)胞培養(yǎng)記錄，記錄加料和傳代時(shí)間、所用培養(yǎng)基種類、解離方法、分種率、形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果、接種濃度、產(chǎn)量和抗生素用法。

　　最好按照傳代時(shí)間安排開(kāi)展實(shí)驗(yàn)和其他非常規(guī)操作 (如更換培養(yǎng)基種類)，如果您的實(shí)驗(yàn)安排與常規(guī)傳代時(shí)間安排不吻合，則應(yīng)確保當(dāng)細(xì)胞仍處于延滯期或者已經(jīng)達(dá)到匯合狀態(tài)、停止生長(zhǎng)時(shí)，不進(jìn)行傳代。

　　貼壁細(xì)胞傳代流程:

　　以下實(shí)驗(yàn)方案介紹了貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞傳代的一般流程,為自己所用的細(xì)胞系傳代時(shí)，建議您嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)中所有產(chǎn)品附帶的操作說(shuō)明,偏離某種細(xì)胞所需的培養(yǎng)條件會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞表型異常，甚至培養(yǎng)*失敗。

　　(1)傳代前準(zhǔn)備

　　用具紫外照射消毒(30min)：無(wú)菌培養(yǎng)瓶，15ml離心管，移液管，移液槍，槍頭。

　　倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。

　　(2)胰蛋-白酶/EDTA消化

　　從培養(yǎng)箱中取出待傳代的細(xì)胞(將蓋子擰緊)，75%酒精進(jìn)行瓶口消毒，吸掉培養(yǎng)細(xì)胞的舊培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗去殘留的舊培養(yǎng)基，按25m2/ml消化液比例加入消化液，消化液中EDTA濃度視不同細(xì)胞而定。放入顯微鏡下觀察，待所有細(xì)胞變圓后立即拿入超凈臺(tái)內(nèi)，加入6ml細(xì)胞*培養(yǎng)基中止消化，消化時(shí)間為1-5min，具體以細(xì)胞而議，采用無(wú)菌吸管輕輕吹打細(xì)胞表面，注意吹打全部培養(yǎng)表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有的細(xì)胞懸液放入干凈的15ml離心管內(nèi)，每分鐘1000rpm，RT5min。

　　(3)制備細(xì)胞懸液及培養(yǎng)

　　吸取上清液丟棄，不要吸到底部的細(xì)胞沉淀，向離心管內(nèi)的細(xì)胞沉淀加入適量*培養(yǎng)基，吹打混勻，吹打過(guò)程中盡量不要產(chǎn)生氣泡，以1:2的比例進(jìn)行分瓶。

　　(4)結(jié)果觀察

　　第二天觀察細(xì)胞情況，細(xì)胞培養(yǎng)換液時(shí)間一般2-3天。

　　(5)注意事項(xiàng)

　　1 嚴(yán)格無(wú)菌

　　2 適度消化：把握好消化液的最佳濃度

　　3 吹打細(xì)胞動(dòng)作要輕柔

　　懸浮細(xì)胞傳代流程

　　懸浮細(xì)胞傳代就比較容易了，可以直接將培養(yǎng)瓶中的液體吸掉，只留下少量，然后加入新鮮培養(yǎng)液即可。當(dāng)細(xì)胞懸液中碎片或顆粒物較多，感覺(jué)到比較臟時(shí)，可以將懸液移到離心管內(nèi)，1000-1500rpm離心3min，棄上清，加入約2ml培養(yǎng)液，吹打至均勻，滴加2-3滴至已加入新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，然后置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。